Дэвид Уильям Духовны родился 7 августа 1960 года в Нью-Йорке, США. В семье было трое детей. Когда Дэвиду было 11 лет, родители развелись.

Дэвид хорошо окончил школу и поступил в Принстонский университет на факультет педагогики. Он хотел стать писателем. Чтобы заработать себе на учебу, он подрабатывал доставщиком продуктов, сторожем и барменом. Окончив университет, он поступил в аспирантуру в Йельском университете, после окончания которой получил степень магистра английской литературы и стал готовился к защите докторской диссертации по теме «Магия и технология в современной поэзии и прозе».

На телевидении Дэвид Духовны впервые появился в 1987 году, снявшись в рекламе пива Löwenbräu. Он бросает подготовку докторской диссертации и берет уроки сценического мастерства. В 1988 году он попадает в Голливуд и снимается в эпизодической роли в фильме Майка Николса «Деловая девушка».

Затем режиссер Дэвид Линч пригласил Духовны на роль трансвестита-агента службы по борьбе с наркотиками в трёх эпизодах сериала «Твин Пикс». Затем он снялся в роли покинутого любовника-рассказчика в фильме «Дневники Красной Туфельки». Продюсер студии «XX Век Фокс» Рэнди Стоун обратил на него внимание и порекомендовал Крису Картеру, режиссеру «Секретных материалов» на роль Фокса Малдера. В 1993 году Духовны стал сниматься в научно-фантастическом сериале «Секретные материалы» в ведущей роли агента ФБР Фокса Малдера, которая принесла ему мировую славу.

Одновременно Дэвид несколько раз снялся в культовом сатирическом «Шоу Ларри Сандерса» в роли самого себя. Он также озвучил главного героя компьютерной игры «XIII» в 2003 году, а также Этана Коула из видеоигры «Area 51».