Уильям (Уиллем) Дефо родился 22 июля 1955 года в городе Эпплтон, штат Висконсин (США). Он с детства увлекался театром и искусством. Повзрослев, Уильям принимает решение изучать драматическое искусство. Он поступил в университете Милуоки, который так и не сумел закончить: начинающий актёр отправился на гастроли с авангардным театром «Theatre X».

Уильяму, впрочем, не пришлось сожалеть о неоконченной учёбе в университете. Вместе с театром он очень успешно гастролировал по США и Европе в течении 4-х лет. Впоследствии Дефо поселился в Нью-Йорке, где начал работать в театральной труппе «The Performance Group».

В 1980 году молодой актёр снялся в фильме Майкла Чимино «Врата рая», однако кадры с его участием не вошли в конечную версию картины. В последующие годы Дефо снялся в фильмах «Нелюбимый» Кэтрин Бигелоу и «Жить и умереть в Лос-Анжелесе» Уильяма Фридкина, которые принесли ему известность. Критики позитивно оценили игру актёра.

В 1986 году за роль в фильме Оливера Стоуна «Взвод» Уильям Дефо был номинирован на «Оскар» как «Лучший актёр второго плана». Эта роль является одной из самых удачных работ Дефо в кино.

Не менее удачными были его роли в фильмах «Последнее искушение Христа»(1988), «Миссисипи в огне» (1988), «Рождённый четвёртого июля»(1989), «Дикие сердцем»(1990), «Английский пациент»(1996), «Прямая и явная угроза»(1994), «Авиатор»(2004) и др.

Одной из последних работ Уильяма Дефо стала роль в фильме «Светлячки в саду», который вышел на экраны в 2008 году.